产品货号：
JN0011
中文名称：
M-MuLV反转录酶(RNase H-)
英文名称：
BalbScript Reverse Transcriptase(RNase H-)
产品规格：
10kU|50kU
发货周期：
1～3天
产品价格：
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本制品是通过基因重组技术克隆表达的缺失突变型RNase H-的M-MuLV反转录酶。一般的野生型M-MuLV（Moloney Murine Leukemia Virus）具有以下几种活性：依赖于RNA的DNA聚合酶活性；依赖于DNA的DNA聚合酶活性；RNase H活性。由于RNase H能够催化降解DNA/RNA杂合体中的RNA，因此在cDNA第一条链的合成反应中可能会降解RNA/DNA杂合体中的模板RNA。本酶的RNase H活性缺失，延伸能力强，可用于较长的cDNA合成，高比例的全长cDNA文库的构建以及Real Time RT-PCR反应等。
- 1st Strand cDNA的合成；
- cDNA Probe的制备；
- RT-PCR反应以及Real Time RT-PCR反应。
| 组分 | 规格 |
| BalbScript M-MuLV反转录酶(RNase H-,200U/μL) | 50μL |
| 5×BalbScript RT Buffer | 1mL |
保存：-20℃。
经多次柱纯化，SDS-PAGE胶检测仅可见清晰单一目的条带，PCR方法检测无大肠杆菌DNA残留，无核酸内、外切酶污染，无RNA酶污染。
以Poly(rA)·Oligo（dT）为模板/引物，在37℃、10分钟条件下，掺入1nmol的[3H] dTTP所需要的酶量定义为1个活性单位。
- 用DEPC处理实验用到的所有实验器材，或者购买已经证明无核酸酶的实验用具，实验过程戴手套并经常更换手套，避免RNA酶的污染。
- 确保所用试剂及超纯水中无RNA酶污染。
- 纯化过的RNA必须保证不含有盐，金属离子，乙醇和苯酚，以上成分会干扰第一链cDNA的合成反应。可采用乙醇沉淀RNA的方法去除掉痕量污染物。
- 为保证反转录反应的有效进行，需使用高质量的RNA模板。
操作方法：
一、cDNA第一链合成反应体系
试剂融化后，将试剂盒中各组分混匀并稍微离心后置于冰上。
- 按顺序加入以下反应物：
成分 用量 模板RNA 总RNA(0.1ng～5μg) poly(A) mRNA(10pg) 特异性RNA(0.01pg) 引物 Oligo (dT)18 1μL Random N6 1μL 基因特异性引物15～20pmol 5×BalbScript RT Buffer 4μL RNase Inhibitor(40U/μL) 1μL dNTPs(10mM) 2μL BalbScript M-MuLV反转录酶(200U/μL) 1μL RNase-Free Water 至20μL - 如果RNA模板GC含量高或者含有二级结构，可先将RNA模板和RNase Free Water混匀后，65℃孵育5分钟，冰上冷却，再加入其它组分。
- 轻轻混匀，离心。42℃孵育15～30分钟。如果RNA模板中不含polyA结构，25℃先孵育5分钟，随后42℃孵育15～30分钟。
反应产物可直接用于PCR，如果不立即使用，-20℃保存少于一周，长时间保存建议-70℃放置。- 有实验结果提示，本反转录酶可在15分钟内完成1kb反转录反应。
二、第一链cDNA的PCR扩增
合成的第一链cDNA可直接用于PCR。
- 常用反应体系（50μL）：
注：Mg2+终浓度为2mM成分 用量 2×Taq Master Mix 25μL 上游引物 0.2～1.0μM（终浓度） 下游引物 0.2～1.0μM（终浓度） 模板 1～2μL ddH2O 至50μL - 常用PCR循环：
温度 时间 循环数 94℃ 90sec 1 94℃ 20sec 30 57℃ 20sec 72℃ 1kb/60秒 72℃ 5min 1 4℃ 保温 1
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